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La culture in vitro : premiers pas...

Par Mélanie Quennoz, 2001/11/11.

La culture in vitro est une technique de laboratoire qui permet de multiplier des plantes en grand nombre, dans un espace réduit. Elle est actuellement utilisée pour multiplier des plantes ou des variétés rares, poussant lentement, ne donnant pas ou peu de graines ou de rejets, ceci afin de répondre aux demandes commerciales.
Cette technique peut se décomposer en trois étapes : l'installation, la multiplication et le sevrage.

Le r√īle des hormones v√©g√©tales

www.cactuspro.com_images_article020-01r.jpgUne hormone est un compos√© organique synth√©tis√© dans un organe, transport√© vers des cellules cibles dans lesquelles il d√©clenchera une r√©action pr√©cise. Chez les v√©g√©taux, on conna√ģt actuellement 5 groupes d'hormones, qui agissent principalement sur la division cellulaire (donc la croissance de la plante) et leur diff√©renciation (la formation de divers organes). L'effet des hormones d√©pend √† la fois de leur concentration, de leur site d'action, du stade de d√©veloppement de la plante ainsi que de leur concentration relative (une hormone pouvant inhiber le r√īle d'une autre). Vous trouverez ci-apr√®s un r√©sum√© des principales actions de ces mol√©cules.

  • Les Auxines : L'auxine extraite des v√©g√©taux est l'acide indolac√©tique. D'autres compos√©s, y compris des substances synth√©tiques, ont le m√™me effet (acide 2,4-dichloroph√©noxyac√©tique, acide indole-3-ac√©tique, acide indole-3-butyrique, acide 1-naphthal√®neac√©tique). Sa synth√®se a principalement lieu dans le m√©rist√®me apical des pousses (groupe de cellules non diff√©renci√©es, sans fonction autre que de se diviser et participer ainsi √† la croissance de la plante). Elles stimulent l'√©longation de la tige, la diff√©renciation et la croissance des racines (sur une bouture par exemple), la fructification (les graines qui se forment produisent de l'auxine et provoquent ainsi le m√Ľrissement du fruit). La pulv√©risation d'auxines sur des plants de tomates donne des fruits sans pollinisation, et les tomates obtenues sont sans graines.
  • Un bourgeon apical produit de l'auxine qui, en descendant dans la plante, inhibe la croissance des bourgeons lat√©raux. Il n'y a donc pas de ramification, c'est ce que l'on nomme la dominance apicale. Les auxines jouent aussi un r√īle dans la capacit√© qu'a la plante de se tourner vers la lumi√®re (phototropisme des feuilles) et de se diriger vers le sol (g√©otropisme des racines).
  • Trop d'auxines inhibe la croissance cellulaire.
  • www.cactuspro.com_images_article020-02r.jpgLes cytokinines : Ces hormones (z√©atine, BAP, kin√©tine, etc.) sont synth√©tis√©es dans les tissus en croissance active, plus particuli√®rement dans les racines, les embryons et les fruits. Elles sont transport√©es dans les autres organes par la s√®ve brute (l'eau que la plante a absorb√©e du sol). En culture in vitro, leurs effets sont li√©s √† ceux de l'auxine. On cultive un morceau de tige sans hormone, les cellules deviennent tr√®s grosses mais ne se divisent pas, si on ajoute une cytokinine, rien ne se passe, mais si on ajoute la m√™me quantit√© d'auxine, les cellules se divisent, mais restent indiff√©renci√©es, on obtient un cal. S'il y a plus de cytokinines, le cal se diff√©rencie et des bourgeons apparaissent, s'il y a plus d'auxines, des racines se forment. Elles inhibent les auxines, provoquent la ramification, retardent la s√©nescence (on en pulv√©rise sur les fleurs coup√©es pour conserver leur fra√ģcheur).
  • Les gibb√©rellines : Ces mol√©cules sont produites dans les jeunes feuilles et les racines. Elles favorisent la germination des graines, le bourgeonnement apr√®s une p√©riode de dormance, l'√©longation de la tige et la croissance des feuilles, stimulent la floraison et la fructification. Leur action est souvent simultan√©e √† celle des auxines.
  • L'acide abscissique : Il est produit dans les bourgeons. C'est lui qui inhibe la croissance, freine la division cellulaire, ferme les stomates en p√©riode de s√©cheresse et d√©clenche la dormance. Cet acide est soit lessiv√© lors de fortes pluies, soit d√©grad√© par la lumi√®re, mais la germination des graines d√©pend √† la fois de la quantit√© d'acide abscissique, de celle des gibb√©rellines, et de facteurs ext√©rieurs propres √† chaque esp√®ce (temp√©rature, etc.).
  • L'√©thyl√®ne : C'est la seule hormone v√©g√©tale sous forme gazeuse. Il inhibe la croissance et est √©galement associ√© √† plusieurs processus de vieillissement (chute des feuilles, maturation des fruits). Il favorise la maturation des fruits, en d√©gradant la paroi des cellules, ce qui ramollit le fruit, bloque la synth√®se de la chlorophylle, le fruit perd sa couleur verte. C'est aussi l'hormone de la floraison chez certaines plantes. Exemple : placez un plant d'ananas dans un sac plastique avec quelques pommes presque m√Ľres (elles d√©gagent de l'√©thyl√®ne), laissez-le ainsi quelques semaines, et vous verrez appara√ģtre la hampe florale de votre plante.

L'installation

C'est la phase qui consiste à désinfecter les boutures (mamelon avec aréole, racine, bourgeon, etc.) ou les graines afin de les rendre stériles, avant de les placer sur un milieu de culture approprié. Différentes méthodes existent, deux sont présentées ici :

Méthode 1

Matériel

  • Eau st√©rile
  • Papiers-Filtres non st√©riles
  • Agrafeuse
  • Un b√©cher (ou r√©cipient servant de poubelle)
  • Une minuterie
  • Solution √† 0.8 % de Javel, contenant 2 gouttes de mouillant (Triton, teepol, liquide vaisselle,‚Ķ)
  • Solution √† 3 % de Kohrsolin (Bode) liquide de d√©sinfection du sol.
  • Alcool 70%

Méthode

  • Placer les graines dans un sachet fait √† partir de papier-filtre pli√© et agraf√©.
  • Mouiller le sachet dans un bain d'alcool 70 %.
  • Placer le sachet dans le m√©lange Javel 0.8 % + mouillant pendant 15 √† 20 minutes et agiter de temps en temps.
  • Vider la Javel, rincer une fois le sachet √† l'eau st√©rile.
  • Placer le sachet dans le bain de Kohrsolin 3% durant 15 √† 20 minutes et agiter de temps en temps.
  • Vider le r√©cipient et rincer trois fois √† l'eau st√©rile. Chaque rin√ßage durant plusieurs minutes.
  • Placer les graines sur milieu de culture.

Attention, ne rien écrire sur les sachets, tout s'efface !

Installation de boutures :
Le principe est le même, des bourgeons avec suffisamment de tissus sont placés dans l'alcool, puis dans la javel, puis dans le Kohrsolin et enfin rincés. Ensuite, ils sont retaillés et placés sur milieu de culture.

Méthode 2

Matériel

  • Eau st√©rile
  • Alcool 70%
  • Solution √† 0.2% de HgCl2

Méthode

  • Laver les boutures √† l'eau courante.
  • Les placer dans l'alcool √† 70% durant 45 secondes.
  • Les placer dans la solution de HgCl2 pour 3 minutes.
  • Rincer cinq fois √† l'eau st√©rile.
  • Rafra√ģchir les surfaces de coupe et placer les boutures sur leur milieu de culture, la coupe touchant le milieu.

Milieu de culture :
Il existe une multitude de milieux de culture. Ceux-ci doivent fournir à la plante tous les éléments nutritifs dont elle a besoin. On distingue deux types de milieux, ceux ayant une consistance liquide et servant aux cultures de cellules, et ceux 'solides', ayant la consistance d'un flan, servant aux cultures de tissus, bourgeons, racines ou cals.
Celle que je présente ici est celle que j'ai eu l'occasion d'utiliser avec de bons résultats. C'est un milieu Murashige-Skoog enrichi de divers éléments, dont des vitamines.

Elément Quantité, en mg/l
KNO3 1900
NH4NO3 1650
CaCl2 * 2 aq. 440
MgSO4 * 7 aq. 370
KH2PO4 170
MnSO4 * 4 aq. 16,9
ZnSO4 * 7 aq. 8,6
CuSO4 * 5 aq. 0,025
H3BO3 6,2
KI 0,83
Na2MoO4 * 2 aq. 0,25
CoCl2 * 6 aq. 0,025
Na2 EDTA 37,2
FeSo4 27,8
Myoinositol 100
Thiamine-HCl 1
Acide nicotinique 0,5
Pyridoxine HCl 0,5
Saccharose 30000
Agar 6000
pH 5,7 - 5,8

La multiplication

En horticulture, on prélève un groupe de bourgeons (une tige), on le met à raciner (bouture, marcottage), on le laisse grandir, et on peut reprendre un autre groupe de bourgeons et ainsi de suite.
Avec les cultures en laboratoire, et gr√Ęce aux hormones, il est th√©oriquement possible de multiplier une plante √† partir d'une seule cellule. Le choix des hormones et de leurs concentration doit √™tre optimis√© pour chaque esp√®ce afin que cette th√©orie soit r√©alisable. Beaucoup de plantes ne sont que peu √©tudi√©es, surtout parce qu'elles n'ont pas ou peu de valeur √©conomique.
Plusieurs techniques de multiplication existent, chacune avec leurs avantages et inconvénients, je vous présente ici certaines d'entre elles. Les concentrations des hormones ont été optimisées pour Coryphanta elephantidens, et elles ne sont malheureusement pas valables pour tous les cactus.

  • De bourgeon √† bourgeon : Des tubercules sont pr√©lev√©s sur une plante adulte, d√©sinfect√©s et mis en culture sur milieu MS contenant 3% de sucre (saccharose) et 6.6 ?M 8-benzylaminopurine (une cytokinine). Sur chaque tubercule se forment alors plusieurs bourgeons, qui peuvent √™tre repiqu√©s sur milieu MS. Ces bourgeons s'enracinent et un petit cactus se forme. C'est la premi√®re m√©thode de multiplication, √† ce stade, on peut soit les sevrer, c. √† d. les mettre en terre, soit les r√©utiliser comme boutures pour reformer des plantes, c'est ce qui a servi dans cet exemple.
  • De bourgeon √† bourgeon avec une phase de cellules non diff√©renci√©es : Les pointes des racines sont pr√©lev√©es (les meilleurs r√©sultats ont √©t√© obtenus avec des fragments de 1 cm de long) et mises en culture sur milieu MS contenant 3% de sucre, 4.6 ?M de kin√©tine (cytokinine) et 9.06 ?M d'acide 2-4-dichloroph√©noxyac√©tique (auxine). Ces fragments sont plac√©s √† l'obscurit√© durant une semaine, afin de ne provoquer aucune diff√©renciation des cellules puis plac√©s √† la lumi√®re. On obtient alors des cals (amas de cellules non diff√©renci√©es) qui peuvent √™tre fractionn√©s √† l'infini, m√™me si certains d√©g√©n√®rent apr√®s quelques repiquages. Les cals laiss√©s √† la lumi√®re et repiqu√©s sur un milieu MS contenant 7% de sucre, 4.6 ?M de kin√©tine (cytokinine) et 2.2 ?M d'acide 2-4-dichloroph√©noxyac√©tique (2-4-D) se diff√©rencient en une structure nodulaire verte compacte puis en bourgeons verts √† tubercules pro√©minents portant des √©pines blanches.
  • En optimisant chaque concentration d'hormone et de sucre, on arrive √† produire trois cactus par cal. Chaque petit cactus peut enfin √™tre plac√© sur milieu MS sans r√©gulateur de croissance o√Ļ il formera des racines apr√®s environ deux semaines.
  • De bourgeon √† bourgeon avec une phase de cellules non diff√©renci√©es : Apr√®s avoir obtenu des cals friables ( en augmentant la quantit√© de 2-4-D), on les place en milieu liquide sous agitation continue. Cette √©tape a pour but d'isoler les cellules. Chaque cellule ou groupe de quelques cellules est alors plac√© sur un milieu contenant des hormones permettant la diff√©renciation. On obtient ainsi un bourgeon par groupe de cellules. Ce bourgeon sera ensuite repiqu√© sur milieu MS o√Ļ il formera des racines.

Enracinement :
Le traitement aux hormones pour la production de racines est inutile pour la plupart des Cactaceae. On dispose les pousses sur milieu MS standard (ou CMS), et les racines apparaissent environ deux semaines après inoculation.

Le sevrage

C'est la mise en terre, le passage des conditions de laboratoire aux conditions de serre. Cette phase s'avère souvent critique, car les plantes en tubes ont perpétuellement leurs stomates ouverts (pores permettant les échanges gazeux oxygène, CO2, vapeur d'eau, entre la plante et son environnement), et ne savent plus les fermer. Même les plantes succulentes peuvent sécher si le changement d'environnement se fait trop brusquement.
En prenant quelques précautions, le taux de survie atteint les 100%.

  • Les tubes ouverts sont plac√©s dans une serre sous brouillard sec (fine brumisation de gouttes si fines qu'elles ne se d√©posent pas, humidit√© relative 100%) pendant 2 jours.
  • Les plantes sont sorties de leur milieu de culture, les racines sont nettoy√©es, puis elles sont mises en terre, plac√©es √† nouveau dans un lieu tr√®s humide pour une semaine, puis elles prennent place dans une serre normale.
  • Les plantes enracin√©es sont plac√©es dans un substrat compos√© de 50% de sable et autant de vermiculite, plac√©es sous cloche (ou film plastique), et arros√©es un jour sur deux durant deux semaines. Enfin, elles sont rempot√©es dans leur pot d√©finitif avec un substrat ad√©quat.

Remerciements

Je tiens particulièrement à remercier Guillaume Lenormand qui m'a donné le feu vert pour la parution de ce texte. Merci également à Yann, qui a su attendre patiemment la venue de cet article durant de longs mois. Et enfin merci à tous ceux qui ont pris la peine de m'avoir lu, certains y auront, j'espère, trouvé des idées à tester ou des informations utiles, d'autres aussi l'ennui d'une lecture digne d'un dimanche matin pluvieux, je m'en excuse auprès d'eux.

Auteur : Mélanie Quennoz.
Publié le : 2001/11/11.
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Note du webmestre : certaines opérations décrites ici peuvent être délicates, les produits cités peuvent être dangeureux. Prenez toutes vos précautions si vous tentez une mise en pratique. Merci également à Alain pour l'ultime relecture.

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